最新研究成果 RDS，可游离抑制新冠、非典及甲型流感病毒感染

A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro

Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*

▋摘要

或多或少：现今正肆虐亚洲地区的新型乙型感染病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家政府和周边地区大风靡一时，截至 2021 年 4 年底已避免多达 1.28 亿人感染者，多达 280 都来丧生。意味著，已有可合理减缓 COVID-19 误杀率的疗程人口统计分析方法。我们研究者了一种宗教性的药口服制剂——祛肺毒口服液 (RDS) 的潜在抗病毒乙型感染活性，该口服液主要组分为圣城医学宗教性中所主要用途疗程腹腔结核病的药材。

结果：RDS 选择性 SARS-CoV 快病疗效、SARS-CoV-2 快病疗效、混和流感病毒病疗效-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型病疗效以及传染性 SARS-CoV-2 和为基础的 Ha-CoV-2 新品种病疗效 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对双链会的感染者。我们大幅度证明了 RDS 可以直接灭活 SARS-CoV-2 病疗效固体的传染性。此外，我们发掘出新 RDS 还可绕过流感病毒流感病疗效对双链会的感染者。

结论：RDS 可尤其选择性口腔病疗效感染者。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，乙型感染，抗病毒病疗效疗程，祛肺毒口服液，宗教性药，SARS-CoV，流感病毒流感，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型病疗效

▋或多或少

现今正肆虐亚洲地区的新型乙型感染病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家政府和周边地区大风靡一时，截至 2021 年 4 年底已避免多达 1.28 亿人感染者，多达 280 都来丧生。意味著，已有可合理减缓 COVID-19 误杀率的疗程人口统计分析方法。新再次出新现的 COVID-19 病疗效病原体为乙型感染 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在轻微急性呼吸症候群就其乙型感染种类中所的表兄弟病疗效[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在西方发掘出新的；SARS-CoV 病疗效于 2002 年 11 年底在佛山市首次被发掘出新[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年底在武汉首次被发掘出新[1,7,8]。在西方，这两次由乙型感染引起的登革热中所，药仅仅被尤其采用，用以紧急应对乙型感染引起的结核病。对于意味著的 COVID-19 大风靡一时，西方有多达 85% 的 SARS-CoV-2 感染者病患者遵从了宗教性中所医药临床（9，10）。许多采用的药确实不具合理的抗病毒乙型感染特性并在针灸上确实合理，这个重要弊端已经给予充分答复。

药作为疗程乙型感染所引来结核病的合理临床，但由于依赖于体内或体外的系统研究者，其发展与合理采用仅仅受到了阻碍。为了尽量避免药的潜在抗病毒 SARS-CoV-2 活性，我们从常用药中所比对了多种药材杀菌剂，并从药口服液 RDS(旧金山一种金融业性食品补充品) 中所发掘出新了抗病毒 SARS-CoV 和抗病毒 SARS-CoV-2 病疗效的活性，一种在旧金山的金融业食品补充品。RDS 主要用途增强消化系统呼吸系统的总体健康，其值得注意多种药材组分，如荞麦和荆芥，它们是宗教性上主要用途控制炎症和腹腔结核病的药材 (11-13)。在此，我们华盛顿邮报 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假病疗效以及不具感染者性的野生型 SARS-CoV-2 病疗效对双链会的感染者不具选择性作用。我们大幅度证明 RDS 可通过直接灭活病疗效固体或阻挡病疗效侵入而选择性病疗效的晚期感染者预期。此外，我们发掘出新 RDS 还可以阻挡七轮流病疗效对双链会的感染者。这些表明，RDS 对口腔病疗效的感染者可能不具尤其的选择性作用。

▋结果

为了从宗教性药材中所找到潜在的抗病毒 SARS-CoV-2 活性，我们从共约四十种宗教性药材中所比对分离出出新 SARS-CoV-2S 受体假型快病疗效[14,15] 和消化系统腹腔 A549(ACE2) 双链会，此生命体 ACE2 基因会通过快病疗效转导作为媒介介导，从而稳定转导来实现激理解。快假型病疗效采用绿色红外受体 (GFP) 或红外效酶 (Luc) 作为华盛顿邮报基因，并通过了不具广谱抗病毒病疗效转到选择性剂，以及贝拉多尔 (Arbidol)[16]，和生命体抗病毒毒血清威慑 SARS-CoV-2(三幅 1a、C) 的有效性。我们才可要最终监测到贝拉多尔 (Arbidol) 和抗病毒毒血清对于 SARS-CoV-2 假型病疗效的选择性作用，这是我们在其他四十余种宗教性药材杀菌剂次测试中所很难发掘出新的，最主要其中所一些实际上极高疗效的药材 (三幅 1a-C)。然而，鉴于快性假型病疗效仅仅能监测 SARS-CoV-2 病疗效的侵入行径，我们不能排除这些药材杀菌剂可能有在转到后阶段才可要选择性 SARS-CoV-2 的可能性。我们大幅度从宗教性抗病毒生效祛肺毒口服液 (RDS) 中所比对出新了可能的抗病毒 SARS-CoV-2 活性，该的产品所含有可有药材组分——、茴香、荞麦、荆芥、玄参、苦杏仁、蜂房、皂角、冬瓜，在西方宗教性上主要用途疗程腹腔结核病 (11-13)。

所含有烷基蜂蜜硫、3，4-二邻蜂蜜酰基高纯度硫、烷基 3，4-二邻蜂蜜酰基高纯度硫、原儿茶硫、烷基绿原硫和木犀草效；淡紫色中所还所含有胺 A、B 和 10 种已知环酚醚天冬氨酸胺[17]；该木本植物还所含有皂甙甙 A 和 B，以及抗病毒炎症作用的胺 C[18,19]。茴香胺胺中所所含有木脂效、松脂醇和茴香胺[20]。荞麦中所所含有被称为荞麦皂胺的甾体皂胺，是荞麦属木本植物独有的木本植物化学物质[21,22]。大花荆芥中所主要活性组分为四种单天冬氨酸，(−)-薄荷酮、(+)-博莱格酮、(−)-柠檬酚和 (+)-薄荷呋喃；这种木本植物还所含有其他氧化物，如 1-辛酚-3-醇、3-辛酮、β-年底桂酚和β-石竹酚[23]。玄参所含有多达 162 种氧化物，最主要环酚醚天冬氨酸和环酚醚天冬氨酸胺、苯丙胺、有机硫、苯酚、糖类、黄酮类、和皂胺[24]。苦杏仁中所所含有酚类、氰基氧化物和糖类多糖[25]。皂角刺中所所含有皂胺和羽扇豆硫[26,27]，而冬瓜中所所含有主要活性组分冬瓜硫[28]。为了大幅度次测试 RDS 的抗病毒 SARS-CoV-2 活性，用不同一化学合成溶解度的 RDS 程序中事件 A549(ACE2) 细胞会，然后让这些细胞会在实际上 RDS 的意味着遵从 4-6 同一时间的感染者。感染者后，在不实际上 RDS 的意味着培植细胞会，然后在 48 和 72 同一时间的时候，通过流比较简单式细胞会术对病疗效感染者的选择性作用来进行分析。为了控制细胞会疗效，采用碲丙啶 (PI) 对快要丧生和已丧生的细胞会来进行染色，仅仅在活细胞会群中所人口统计分析 GFP+细胞会。如三幅 2 请注意，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假病疗效不具副作用发挥作用选择性作用。为了猜测这些结果，我们采用内源性理解 ACE2 的 VeroE6 细胞会每一次了该感染者试验。

(见下页三幅)

ACE2 外部理解，生产性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 病疗效可对其来进行感染者，ACE2 通常主要用途乙型感染的研究者 (7)。尽量避免在依赖于 ACE2 激理解 [15，29，30] 的意味着，假型病疗效对 VeroE6 的感染者性高于，我们还采用了红外效酶华盛顿邮报基因假型病疗效，该病疗效的华盛顿邮报基因理解由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，不具更好的华盛顿邮报基因敏感性和精确度。

三幅 2：RDS 选择性 SARS-CoV-2(GFP) 假型病疗效感染者 A549(ACE2) 细胞会。

A.A549(ACE2) 细胞会用 RDS 紧接著一化学合成 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型病疗效感染者。将细胞会洗去病疗效和 RDS，并在不实际上 RDS 的意味着来进行培植。流比较简单式细胞会星象监测病疗效感染者选择性情况。未感染者的细胞会和感染者 SARS-CoV-2(GFP) 但私自 RDS 疗程的细胞会作为印证。GFP+细胞会百份已标示出。(PI) 碲丙啶。

B.RDS 的细胞会疗效化学合成。A549(ACE2) 细胞会用 RDS 紧接著一化学合成 4 同一时间，洗去 RDS，无 RDS 培植 48 同一时间。碲丙啶染色鉴别刚刚丧生细胞会和已丧生细胞会，流比较简单式细胞会术人口统计分析。画副作用-底物细胞会疗效双曲线，RDS 的半误杀溶解度 (LC50) 比例为 1:11.9。

如三幅 3A 请注意，我们采用 Luc 报告基因假病疗效和 VeroE6 细胞会来进行感染者试验，捕捉到到 RDS 对该病疗效感染者不具副作用发挥作用选择性作用，并且半数选择性溶解度尽量避免为 1:230RDS 一化学合成度 (三幅 3B)。我们还分析了 RDS 对 VeroE6 细胞会活力的影响，尽量避免了 50% 细胞会丧生副作用为 1:11.8RDS 一化学合成度。

三幅 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假病疗效和野生型 SARS-CoV-2 病疗效的副作用发挥作用选择性选择性作用。用 RDS 紧接著一化学合成程序中事件 A、BVeroE6 细胞会，并用 SARS-CoV-2(Luc) 假型病疗效感染者。将细胞会洗去病疗效和 RDS，并在不实际上 RDS 的意味着来进行培植。在感染者后 72 同一时间用红外效酶监测病疗效感染者的选择性作用。未感染者细胞会和 SARS-CoV-2-luc 感染者但私自过 RDS 疗程的细胞会作为印证。试验每一次三次。画副作用底物双曲线和 RDS 的 I-C50 一化学合成比例为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞会的细胞会疗效也通过碲丙啶染色和流比较简单式细胞会术化学合成。用 RDS 紧接著一化学合成 4 同一时间，洗去 RDS，在不含有 RDS 的意味着培植 72 同一时间。画细胞会疗效副作用-底物双曲线，RDS 的半误杀溶解度 (LC50) 比例为 1:13.8 一化学合成。DRDS 选择性传染性 SARS-CoV-2 感染者。用紧接著一化学合成的 RDS 程序中事件 VeroE6 细胞会，并在 RDS 实际上的意味着感染者 SARS-CoV-2。感染者 48 同一时间后，通过僵菌斑人口统计分析病疗效拘禁后的病疗效复制选择性情况。选择性试验中所一比较简单式内中来进行，并在 Prism7(Graph Pad) 中所采用单向方差 (One-Way ANOVA) 人口统计分析及 Dunnett 后检验 (Dunnett's Post Test)，以此尽量避免人口统计显着性。显著性值用上标表示如下：*p

为了大幅度有效性采用假病疗效给予的结果，我们次测试了 RDS 对于 SARS-CoV-2 感染者的绕过传染性灵活性。如三幅 3D 请注意，RDS 同时也绕过了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞会的感染者。RDS 在一化学合成 1:40 以上时可显著增大病疗效白斑的形成。

综上，通过 SARS-CoV-2 假病疗效与传染性病疗效的表明，RDS 所含有选择性 SARS-CoV-2 感染者的活性组分，可能是通过直接灭活病疗效或绕过病疗效的晚期感染者预期。

为大幅度研究者可能的系统，我们将传染性 SARS-CoV-2 病疗效固体与紧接著一化学合成的 RDS 在 37°C 下预培植 1 同一时间。随后，将液态大幅度共五一化学合成-(10–1 至 10–4)，并申请加有入 Vero 细胞会来进行僵菌斑人口统计分析以尽量避免病疗效感染者性的减缓。如三幅 4A 请注意，我们捕捉到到在 RDS 中所短暂掩盖一同一时间后的病疗效固体，其 SARS-CoV-2 的感染者效价也红褐色副作用发挥作用下降。该结果猜测了 RDS 可合理直接灭活 SARS-CoV-2 病疗效固体的传染性。

我们大幅度次测试了 RDS 确实也能选择性 SARS-CoV-2 病疗效新品种的感染者。为此，我们利用最近开发的混和七轮病疗效-SARS-CoV-2 假型病疗效 (Ha-CoV-2)[31] 来分离出新一复刻版 S 受体比如说，最主要苏格兰比如说 (B.1.1.7)，南非比如说 (B.1.351)，巴西比如说 (P.1)，旧金山比如说 (B.1.429)，和其他几个新兴比如说 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和就其 S 受体基因突变体在 37°C 紧接著一化学合成 RDS 培植 1 同一时间。随后，用该液态感染者 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 双链会。感染者后 12 同一时间，红外效酶推算出新病疗效感染者的选择性作用。如三幅 4B 请注意，我们还捕捉到到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 受体比如说的副作用发挥作用选择性。

我们还次测试了 RDS 绕过 SARS-CoV 感染者的灵活性，采用比如说 SARS-CoV 突刺受体的 GFP 华盛顿邮报基因快病疗效和[15] 实为副作用。我们将人 A549(ACE2) 细胞会用作双链会，将其用复刻版一化学合成的 RDS 程序中事件，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因假病疗效感染者 4-6 同一时间。感染者后在不含有 RDS 的意味着培植细胞会，流比较简单式细胞会术分析监测其对病疗效感染者的选择性作用。正因如此，采用碲丙啶排除刚刚丧生与已丧生的细胞会，仅仅在活细胞会群中所人口统计分析 GFP+细胞会。如三幅 5A 请注意，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型病疗效的选择性作用红褐色副作用发挥作用。我们大幅度猜测了这些结果，并分析了 RDS 介导的选择性与 Luc 华盛顿邮报基因 SARS-CoV 假型病疗效，SARSCoV(Luc)。我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的选择性作用红褐色副作用性依赖，其半选择性溶解度 (IC50) 为 1:70.88 一化学合成度 (三幅 5B，C)。尽量避免 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都采用 ACE2 感染者双链会，我们还次测试了 RDS 的抗病毒病疗效活性确实仅仅针对与 ACE2 有强子的乙型感染。为此，我们监测了一种不就其的负链 RNA 病疗效--流感病毒流感病疗效。它通过病疗效血凝效 (HA) 和细胞会α-唾液硫来感染者双链会。为了分离出新流感病毒流感病疗效，将理解流感病毒流感 A/WSN/33(H1N1) 遗传物质每个片段的 8 个媒介和一个 GFP-华盛顿邮报基因共转染到 HEK293T 细胞会中所。在 RDS 实际上的意味着，收集病疗效固体并主要用途感染者目的 MDCK 细胞会。如三幅 6A 请注意，我们捕捉到到 RDS 对流感病毒流感病疗效的选择性作用红褐色副作用发挥作用。RDS 在 1:40 和 1:80 一化学合成时可完全绕过病疗效感染者，在 1:160 一化学合成MLT-可部分选择性流感病毒流感。RDS 对 MDCK 细胞会的半误杀溶解度 (LC50) 经推算出新为 1:18.5(三幅 6B)。这些表明，RDS 的抗病毒病疗效活性并非针对特定病疗效，而可能才可要尤其选择性多种口腔病疗效，如乙型感染和流感病毒流感病疗效。

▋研讨

在本报告中所，我们证明了宗教性抗病毒生效祛肺毒口服液 (RDS) 所含有广谱抗病毒病疗效活性，可绕过 SARS-CoV、SARSCoV-2 和流感病毒流感病疗效的感染者。虽然 RDS 才可要选择性多种病疗效，但其抗病毒病疗效活性因病疗效各种类型和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 快假病疗效的 I-C50 溶解度为 1:7.9 一化学合成度，对 SARS-CoV-2 快假病疗效的 I-C50 溶解度为 1:230 一化学合成度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 病疗效，I-C50 为 1:40 一化学合成度，对流感病毒流感，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其新品种有不同的选择性作用，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 一化学合成度不等 (三幅 4B)。

(见下一页三幅)

三幅 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和为基础的 Ha-CoV-2 新品种不具副作用发挥作用灭活作用。ASARS-CoV-2 固体加有紧接著一化学合成的 RDS 在 37°C 下培植 1 同一时间。随后，将液态大幅度紧接著一化学合成，并申请加有入 Vero 细胞会中所来进行僵菌斑人口统计分析，以尽量避免病疗效感染者性减缓。选择性试验中所一比较简单式内中来进行，并在 Prism7(GraphPad) 中所采用单向方差 (One-WayANOVA) 人口统计分析和 Dunnett 后检验 (Dunnett'sPostTest) 以此尽量避免人口统计显着性。显著性值用上标表示如下：*p

BHa-CoV-2(Luc) 和就其 S 受体比如说与紧接著一化学合成的 RDS 在 37°C 培植 1 同一时间后，用液态感染者 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 双链会。感染者后 12 同一时间，红外效酶推算出新病疗效感染者的选择性作用。RDS 的 IC50 值的一化学合成度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。

我们大幅度证明了 RDS 可以选择性乙型感染的晚期感染者预期。虽然完全一致的抗病毒病疗效系统已经清楚，但 RDS 可以通过直接灭活病疗效固体或通过阻挡病疗效侵入或绕过病疗效侵入后的晚期预期来阻挡病疗效感染者。在其他几种宗教性药中所也发掘出新了抗病毒 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活性。例如，一种类似于的宗教性药——冬瓜。

冬瓜根中所已证明所含有冬瓜硫效，可选择性 SARS 病疗效[32] 针灸分离株的复制。此外，另一种可主要用途疗程口腔结核病的药——双黄连制剂，已标示出出新在体外以副作用发挥作用手段选择性 SARS-CoV-23CL 受体酶 (3CLpro) 活性。黄芩胺和黄芩效拟作为双黄连绕过 3CLpro[33] 的合理组分。

三幅 5 RDS 选择性 SARS-CoV 假型病疗效对 A549(ACE2) 细胞会的感染者。用紧接著一化学合成的 RDS 程序中事件 A、B 细胞会，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型病疗效感染者。将细胞会清洗，换成病疗效和 RDS，在不实际上 RDS 的意味着来进行培植。在感染者后 48 同一时间和 72 同一时间，通过流比较简单式细胞会术或红外效酶监测来化学合成病疗效感染者的选择性作用。试验每一次三次。画副作用自发双曲线，并画 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 一化学合成度 (C)

三幅 6 RDS 选择性七轮流病疗效对 MDCK 细胞会的感染者。(A) 用紧接著一化学合成的 RDS 程序中事件 MDCK 细胞会 30 分钟，然后用七轮流病疗效 (GFP) 对其来进行感染者。感染者后，在 RDS 实际上下培植细胞会。36 同一时间后用流比较简单式细胞会星象对病疗效感染者的选择性作用来进行化学合成。把未感染者的细胞会与被七轮流病疗效 (GFP) 感染者但私自 RDS 东南侧理事件的细胞会来进行对比。三幅中所标示出了 GFP+细胞会的百份。PI 表示碲丙啶 PI。

(B) 另外还采用了 MTT 推算出新法化学合成了 RDS 对 MDCK 细胞会的疗效，画了细胞会疗效的副作用-底物双曲线，经计数，RDS 的半数误杀溶解度为 1:18.5 一化学合成度 RDS 的合理抗病毒病疗效组分已经尽量避免。然而，RDS 不同于黄芩胺和黄芩效，RDS 可以通过直接灭活病疗效量子来绕过病疗效感染者 (三幅 4)，而黄芩胺和黄芩效则在病疗效生命周期的后期通过绕过病疗效受体酶的活性来发挥作用。然而，RDS 的体外抗病毒 SARS-CoV-2 活性仍才可在今后的食肉动物研究者和生命体抗病毒病疗效中所给予猜测。现今，我们刚刚来进行小型食肉动物试验，以尽量避免 RDS 在体内绕过 SARS-CoV-2 病疗效感染者的潜力。

▋结论

我们的研究者表明，RDS 可尤其选择性口腔病疗效的感染者，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和流感病毒流感。

▋人口统计分析方法

细胞会和细胞会培植

HEK293T (ATCC 伊萨维斯，纽共约州) MDCK (ATCC 伊萨维斯，纽共约州)，VeroE6 (ATCC 伊萨维斯，纽共约州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赠给，伊萨维斯，纽共约州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赠给，伊萨维斯，纽共约州) 现今存留于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔信息技术 Thermo Fisher Scientific) 所含有 10% 热灭活 FBS 和 1×青霉效-科里 (赛默飞世尔信息技术 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞会基质中所分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的溶解度申请加有入嘌呤霉效和潮霉效 B。

质粒转染和病疗效分离出新

含有 SARS-CoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的快性假型病疗效固体由 Virongy LLC (Manassas，VA) 获取，或按照右边说明了的人口统计分析方法[15] 分离出新。简言之，为了分离出新 GFP 华盛顿邮报基因快性假病疗效，HEK293T 细胞会与理解 SARS-CoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的媒介、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了受益红外效酶华盛顿邮报基因快性假型病疗效，将 HEK293T 细胞会与理解 SARSCoVS 受体或 SARS-CoV-2S 受体的媒介、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 来进行共转染。转染后 48 同一时间收集病疗效上清液，离心浓缩，−80℃ 存留。野生型 SARS-CoV-2 病疗效 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 获取。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因质粒和 A/WSN/1933 H1N1 为基础质粒 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi Clark密切合作获取。在流感病疗效 A-GFP 华盛顿邮报基因量子分离出新中所，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 细胞会 (ΔAT6)。48 同一时间后收集病疗效上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 理解媒介购自 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 媒介和 S 受体基因突变媒介。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 受体基因突变量子按照右边说明了人口统计分析方法[31] 来进行分离出新。

病疗效感染者和抗病毒生效选择性试验中所

RDS(祛肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 赠给，利斯堡，纽共约州) 是由马Clark麻省理工学院 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种金融业的产品。RDS 中所所有药材组分仅仅符合《西方药典 2015 年版》「饮片」标准规范，最主要合理组分含有量及摇滚音乐、农药限量监测。RDS 是一种药的共煎剂，再度产物在真空前提条件下蒸发。SARS-CoV-2 抗病毒血清由 LanceA. Liotta 药剂师获取。将贝拉朵尔盐硫盐 (Sigma) 继续悬浮在二烷基亚砜 (Sigma) 中所。对于假型病疗效感染者，12 孔板中所的 A549(ACE2) 细胞会 (来自 Virongy LLC 赠给，伊萨维斯，纽共约州) 或 VeroE6 细胞会用 RDS 程序中事件 30 分钟，在 37℃ 下感染者 4-6 同一时间，然后在新鲜基质中所净化培植 48-72 同一时间。对于 VeroE6 细胞会的感染者，细胞会也被 CoV-2 假型病疗效感染者增强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赠给，伊萨维斯，纽共约州) 程序中事件后，在 37°C 下再东南侧理事件 30 分钟。采用 GloMaxDiscover 酶标星象 (Promega) 人口统计分析细胞会裂解物的红外效酶活性。对于野生型 SARS-CoV-2 感染者，VeroE6 细胞会在 37°C 下用 RDS 程序中事件 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 感染者 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在爱德华米切尔所大学的 BSL-3 转送设施内停留 1 同一时间。细胞会用 PBS 净化 2 次，用含有 RDS 的基质培植 48 同一时间。从上清中所分离出病疗效，用 12 孔板培植的 Vero 细胞会单层中所的僵菌斑试验中所推算出新小瓶滴度。简言之，每个样品在非常简单的 Dul-becco's ModifiedEagle 基质 (VWR) 中所分离出新，值得注意 1X 青霉效-科里 (VWR)，并移除 10% 的 FBS(赛默飞世尔信息技术 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种一化学合成液吸附到 VeroE6 细胞会单层的三个平行孔上 1 同一时间。然后用 1～2 ml0.6% 罗济夫糖 (Invitrogen) 和一部分非常简单的 Eagle Minimal Essential 基质 (VWR) 的液态覆盖单层，含有 1X 青霉效-科里，并移除 10%FBS。48 同一时间后，将单层膜比较简单在 10% 七轮醛氢氧化钠中所 1 同一时间，并掺入覆盖的罗济夫塞。为了染色白斑，申请加有入所含有 20% 苯酚的 1% 结晶紫原料氢氧化钠 5 分钟，然后用去离子水净化。对于流感病毒流感病疗效感染者 MDCK 细胞会，在 37°C 下用 RDS 程序中事件 30 分钟，然后用 A-GFP 华盛顿邮报基因病疗效感染者 6 同一时间。用含有 RDS 的基质净化细胞会，培植 36 同一时间。GFP 理解通过流比较简单式细胞会星象化学合成。(FACSCalibur，BD Biosciences).

对于 SARS-CoV-2 病疗效固体的 RDS 灭活试验中所，将 100μl 紧接著一化学合成的 RDS 移除到 1 mlSARS-CoV-2 病疗效原液 (3.65×105PFU/ml) 中所，再度 RDS 一化学合成为 1:20，1:40 或 1:80。也最主要印证前提条件 (1 ml 病疗效+100μl 基质)。液态在 37°C 下培植 1 同一时间。随后，对液态来进行复刻版一化学合成以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 一化学合成度，并将紧接著一化学合成的样品申请加有入 12 孔板中所的 Vero 细胞会中所，主要用途来进行僵菌斑推算出新人口统计分析。白斑推算出新中所再度的 RDS 一化学合成度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 一化学合成液。

Ha-CoV-2(Luc) 和 S 受体基因突变量子按照右边说明了的人口统计分析方法[31] 分离出新。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活，将 5μl 紧接著一化学合成的 RDS 移除到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或比如说中所，再度 RDS 一化学合成度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将液态在 37°C 下培植 1 同一时间，然后在 RDS 实际上下感染者 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞会 12 同一时间。采用 GloMax Discover 酶标星象 (Promega) 人口统计分析细胞会裂解物的红外效酶活性。

细胞会疗效人口统计分析监测

用碲丙啶染色和流比较简单式细胞会术分析对 A549 (ACE2) 细胞会和 VeroE6 细胞会的抗病毒生效细胞会疗效来进行监测，如所述 (34)。采用细胞会增殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商建议的方案对 MDCK 细胞会的抗病毒生效疗效来进行分析。简言之，将 MDCK 细胞会 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞会的速率疫苗到 12 孔板中所。细胞会培植隔夜后，通过 RDS 东南侧理事件 1 天，然后在 MTT 标记试剂 (Sigma) 的基质中所培植。将细胞会与标记试剂共同培植 4 同一时间，再在此之后申请加有入 MTT 增氢氧化钠。培植皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标星象 (Promega) 推算出新吸光度。

缩写

SARS-CoV：轻微急性呼吸系统症候群就其乙型感染；SARSCoV-2：Severe 轻微急性呼吸系统症候群就其乙型感染-2；TCM：宗教性药；RDS：口腔保健食品口服液；Ha-CoV-2：混和流感病毒新冠病疗效假病疗效。

致谢

感谢 FengLi 获取流感病疗效理解媒介，感谢 LanceLiotta 获取抗病毒毒血清；感谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的研讨与建议；感谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 获取 RDS 和药材杀菌剂。

编者表彰

此次试验由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 新设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 总编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该试验。所有编者已阅读并批准再度稿件。

资金

本研究者的经费来自于爱德华米切尔所大学外部拨出新 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 获取。

数据和材料的可用性

本研究者中所产生或人口统计分析的所有数据仅仅值得注意在本文中所。试剂可从 Y.W 东南侧获取。

声明

批准及参与达成协议

不符合

达成协议出新版

不符合

挑战公共利益

爱德华米切尔所大学国家政府海洋生物布署和风靡一时病中所心的 RMH 和 YW 已给予了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的研究者资助，LAH 为德佳和畅担任高级顾问并给予了酬金。很难其他亲密关系或活动可能会影响到提请的工作。

编者详细信息

1旧金山纽共约州爱德华米切尔所大学系统海洋生物学学院国家政府海洋生物布署和风靡一时病中所心，伊萨维斯 20110。

2VirongyLLC，纽共约州伊萨维斯。3加有拿大宰纳比，BCV5J0E5 马Clark麻省理工学院 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 旧金山纽共约州利斯堡的国际科学秘密组织，20176。

收稿一月：2021 年 4 年底 7 日

遵从一月：2021 年 5 年底 10 日

线上出新版时间：2021 年 5 年底 29 日

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